お召し列車には列車番号はなく、ダイヤ上でも「お召し」である。ただし現在のJR東日本では列車の運行管理をコンピュータで行うので、お召し列車にも列車番号を与えている。下りは9001、上りは9002という列車番号が使われることが多いが、必ずしもそうではない。新幹線の場合は、一般の団体臨時列車と同じ列車番号が付けられることが多い。お召し列車の運行には「三原則」がある。
1.他の列車と並んで走ってはならない。
2.追い抜かれてはならない。
3.立体交差では、上の線路をほかの列車が走ってはならない。
このため臨時に他の列車の時間調整を行なうほか、事故などの不測の事態に備えてダイヤ作成担当者がお召し列車に添乗する。
お召し列車担当の運転士は、運転区間を管轄する車両基地内で技術・勤務態度・人間性を踏まえて選ばれる。衝撃のない発車や停止、数秒の狂いもない運転、数センチのズレも許されない停止位置など、通常の列車に比べて極めて細かい運行が求められるため、運転技術がとくに優れている運転士が選ばれている。移動日や時刻は官報によって公に示されている。ただし通常の列車の場合もあるので、必ずしもお召し列車による運行とは限らない。あくまで皇族の行事参加および移動を掲載している。
お召し列車は原則として夜には運転されない。長い時間をかけた戦前には途中の御用邸などで泊まりながら移動していた。例外は、1947年（昭和22年）12月11日に姫新線林野15時42分発、東京翌6時57分着で運転された、お召し列車唯一の夜行列車である。また1946年（昭和21年）6月6日 - 7日に銚子市を訪れた時には、戦災で天皇が泊まるような邸宅や旅館などが銚子に残っていなかったことから、銚子駅の先に在った貨物駅である新生駅に御料車を引き込んで、その中で泊ったことがある。2012年現在まで、天皇が御料車内で泊ったことが認められるのはこの2件のみである。